Maria Younès ,Marissa El Hage ,Wassim Shebaby ,Sahar Al Toufaily ,Jana Ismaïl ,Hassan Y. Naim ,Mohammed Mroueh et Sandra Rizk. Rapports scientifiques volume 14 , Numéro d'article : 25642 ( 2024 )

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Le potentiel anti-métastatique moléculaire du CBD et du THC du cannabis libanais via l'induction de l'apoptose et les altérations de l'autophagie

Maria Younès ,Marissa El Hage ,Wassim Shebaby ,Sahar Al Toufaily ,Jana Ismaïl ,Hassan Y. Naim ,Mohammed Mroueh et Sandra Rizk

Rapports scientifiques volume 14 , Numéro d'article : 25642 ( 2024 ) Citer cet article

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Métriquedétails

Abstrait
La plante médicinale Cannabis sativa L. (C. sativa) fait actuellement l'objet d'études approfondies pour déterminer l'étendue de son potentiel pharmacologique thérapeutique. Le Δ 9 -tétrahydrocannabinol (THC) et le cannabidiol (CBD) sont les composés les plus étudiés. Nous avons cherché à explorer l'activité anticancéreuse d'un mélange de cannabinoïdes isolés de la plante libanaise C. sativa dans des proportions comparables à celles de la plante médicinale locale, afin d'élucider son mécanisme d'action dans les cellules cancéreuses du sein in vitro. Les cellules ont été soumises à un test de cytotoxicité, à une analyse du cycle cellulaire, à une double coloration à l'annexine V/PI, à un ELISA de mort cellulaire, à une immunofluorescence, en plus d'une analyse par transfert Western des marqueurs apoptotiques et autophagiques. Nous avons en outre évalué l'effet anti-métastatique des cannabinoïdes sur MDA-MB-231 en utilisant les tests de cicatrisation par éraflure, de migration trans-puits et d'invasion. Nos résultats ont révélé les avantages thérapeutiques prometteurs du CBD/THC sur l'inhibition de la croissance des cellules cancéreuses du sein en favorisant la fragmentation cellulaire, la translocation de la phosphatidylsérine vers le feuillet de la membrane externe et la fragmentation de l'ADN dans les deux lignées cellulaires tout en inhibant la motilité des cellules cancéreuses du sein triple négatives. Dans notre étude, le mélange CBD/THC s'est avéré présenter une activité pro-apoptotique via l'activation de la voie apoptotique mitochondriale, indépendante de la production de ROS tout en suggérant également l'activation d'une voie apoptotique dépendante de la caspase. Même si l'autophagie a été altérée lors de l'exposition au mélange de cannabinoïdes, nos données suggèrent qu'il ne s'agit pas du mécanisme responsable de l'induction de la mort cellulaire. En conclusion, notre étude démontre les avantages thérapeutiques prometteurs du CBD et du THC isolés de la plante libanaise C. sativa sur les cellules cancéreuses du sein in vitro .

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Introduction
Depuis le début de la civilisation humaine, Cannabis sativa L. ( C. sativa ), communément appelé marijuana ou cannabis, a été utilisé à des fins thérapeutiques et récréatives 1 . Cette plante herbacée est une plante à fleurs dioïque originaire d'Asie centrale et membre de la famille des Cannabacées . En raison de la diversité des phénotypes du genre, le cannabis est taxonomiquement divisé en trois sous-espèces : Cannabis sativa , Cannabis ruderalis et Cannabis indica 2 . Contrairement à ruderalis, les espèces sativa et indica ont été considérablement développées pour leurs avantages thérapeutiques et commerciaux 3 . C. sativa est la substance illicite la plus largement utilisée dans le monde, malgré le fait que de nombreux pays aient légalisé sa production et sa consommation en raison de son intérêt clinique important 4 .

Avant l'utilisation du cannabis dans les systèmes médicaux occidentaux, C. sativa a été utilisé à des fins médicinales pendant au moins 1800 ans en Inde et en Chine, selon des écrits anciens 5 . Cette plante a été documentée pour le traitement de diverses affections, notamment la douleur chronique, la constipation, la fièvre, l'inflammation, la méningite, les troubles dermatologiques et urinaires 1 , 3 , 6 . Actuellement, des études de recherche sont menées pour déterminer l'étendue complète du potentiel thérapeutique des plantes de cannabis. En effet, il est bien établi que ses constituants biochimiques sont principalement responsables des diverses fonctions associées à sa consommation. Plus de 500 composés, dont des cannabinoïdes, des terpénoïdes et des flavonoïdes, ont été trouvés présents dans la plante en fleurs C. sativa 7 , 8 . Parmi ces composés phytochimiques majeurs, on trouve le Δ 9 -tétrahydrocannabinol (THC) psychoactif et le cannabidiol (CBD) non psychoactif mais pertinent sur le plan médicinal 9 . Les THC sont une classe particulière de cannabinoïdes à structure terpénophénolique et représentent environ 20 % du poids total de la plante. Actuellement, on connaît l'existence de dix-huit isoformes de THC dans la plante de cannabis, le Δ 9 -THC étant le composé le plus étudié 10 . De même, le CBD a suscité un grand intérêt pour sa valeur pharmacothérapeutique 11 . De nombreuses études ont soutenu l'utilisation du CBD et du THC dans le traitement de diverses affections, notamment les nausées, les vomissements, les troubles du sommeil et les troubles neurodégénératifs, comme le résument Khalsa et al. dans leur revue 12 .

Des recherches approfondies ont été menées au cours des vingt dernières années pour explorer les perspectives cliniques et biologiques des cannabinoïdes, seuls ou en combinaison, dans le traitement de diverses maladies, dont le cancer. Des études récentes ont montré que les cannabinoïdes exercent une activité anticancéreuse dans presque tous les types de cancer par la suppression de la prolifération cellulaire, de la migration et de l'angiogenèse ainsi que par l'activation de l'apoptose et de l'autophagie lors de l'exposition au CBD et au THC, seuls ou en combinaison 13 , 14 . Il a été démontré que les composés du THC peuvent stopper la progression du cancer du sein, du cerveau, de la leucémie, du poumon, du mélanome, de la prostate, du pancréas, du cancer hépatocellulaire et du côlon in vitro et in vivo 15 . D'autres études ont examiné les propriétés anticancéreuses du CBD dans le cancer du sein, du poumon, du gliome, du myélome, du côlon et de la prostate, entre autres 16 . Cependant, très peu d'études se sont concentrées sur la combinaison de cannabinoïdes sur les cellules cancéreuses. Une étude menée par Marcu et al. Des études sur le glioblastome ont montré que l'association du CBD et du THC pouvait augmenter l'efficacité du traitement par l'inhibition synergique de la prolifération cellulaire et l'induction de l'apoptose 17 . Ces résultats étaient similaires à ceux d'une étude menée sur des cellules de mélanome exposées à des quantités égales de CBD et de THC 18 . Une autre étude a montré un effet synergique du CBD et du THC sur la suppression de la croissance des cellules leucémiques, en particulier lorsqu'ils sont associés à des médicaments chimiothérapeutiques susceptibles d'améliorer la survie des patients 19 .

Plus récemment, une étude menée par Schoeman et al. s'est concentrée sur l'évaluation de l'effet anticancéreux de différents mélanges de CBD et de THC sur le cancer du sein 20 . Cette étude a fourni des preuves supplémentaires de l'effet antiprolifératif prometteur des mélanges de cannabinoïdes sur les cellules cancéreuses du sein sans effet cytotoxique sur les cellules normales 10 . En fait, le cancer du sein est l'une des tumeurs malignes les plus fréquentes chez les femmes et l'une des principales causes de décès dans le monde. Plus de 1,8 million de nouveaux cas de cancer du sein sont découverts chaque année, et les taux d'incidence de la maladie sont toujours en augmentation 21 . L'analyse moléculaire moderne des tumeurs du sein néglige les sous-types morphologiques et les classe selon l'expression positive ou négative de trois récepteurs hormonaux : le récepteur de la progestérone (PR), le récepteur des œstrogènes (ER) et le récepteur 2 du facteur de croissance épidermique humain (HER2) 22 . Les cellules du cancer du sein triple négatif (TNBC) sont considérées comme le type de lignées cellulaires du cancer du sein le plus agressif en raison de l'expression négative des trois récepteurs. Français La chimiothérapie est donc le principal traitement systémique utilisé dans ce cas puisque ces cellules ne sont pas sensibles à la thérapie endocrinienne et moléculaire ciblée 23 . Les cellules courantes du cancer du sein comprennent les cellules MDA-MB-231 hormono-indépendantes (PR-, ER- et HER2-) et les cellules MCF-7 hormono-dépendantes (PR + , ER + et HER2 + ) , toutes deux développées à partir d'individus atteints d'un carcinome canalaire invasif 24 . Malgré les nombreuses techniques médicinales contemporaines utilisées pour traiter les tumeurs du cancer du sein, les patients peuvent ressentir des symptômes graves, notamment de la fatigue, des nausées, une perte de cheveux et une dépression, c'est pourquoi la médecine complémentaire et alternative est intéressante et utilisée de nos jours 25 .

Dans cette étude, nous avons pour objectif d'étudier l'activité anticancéreuse d'un mélange de cannabinoïdes isolés de la plante libanaise C. sativa . En fait, une étude précédente menée par Shebaby et al. a rapporté la caractérisation chimique de la plante libanaise C. sativa révélant sa teneur élevée en CBD par rapport au THC 26 . Dans cette étude, un mélange de CBD et de THC (3:1) dans des rapports comparables à leur abondance dans la plante libanaise a été utilisé pour élucider le mécanisme d'action dans les cellules cancéreuses du sein, étant donné qu'une telle formulation médicinale est capable d'inhiber sélectivement la prolifération des cellules MDA-MB-231 et MCF-7 sans effet indésirable sur les cellules normales 10 .

Matériel et méthodes

Culture de cellules cancéreuses du sein

Deux lignées cellulaires de cancer du sein humain (MDA-MB-231 et MCF-7) ont été obtenues auprès de l'American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, États-Unis). Conformément aux directives de l'ATCC pour le milieu de croissance, les cultures cellulaires ont été maintenues dans des conditions standard (environnement humidifié à 37 °C et 5 % de CO2 ) . Les cellules MDA-MB-231 et MCF-7 ont été cultivées et laissées se développer en monocouche dans du milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis) supplémenté de 10 % de sérum bovin fœtal (FBS, Gibco, Dublin, Irlande) et de 1 % d'antibiotiques (100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine) 27 . Les cellules ont été contrôlées quotidiennement à l'aide du ZOE Fluorescent Cell Imager et divisées lorsqu'une confluence de 70 à 80 % a été atteinte à l'aide de trypsine-EDTA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis). La méthode d'exclusion trypan et un hémocytomètre ont été utilisés pour évaluer et déterminer la viabilité des cellules avant le placage.

Préparation d'extraits végétaux

Le Bureau de lutte contre la drogue de Zahlé, dans le gouvernorat de la Bekaa, a fourni des échantillons séchés d'une souche de cannabis libanaise en octobre 2019 provenant de la vallée de la Bekaa à Yammoune (Yammoune : 34◦07′46,4′′Nord, 36◦01′40,8′′Est ; altitude, 1375 ± 10 m). Le matériel végétal a été stocké en toute sécurité à l'Université libanaise américaine et un spécimen de plante a été déposé à l'herbier du Département des sciences naturelles de l'Université (ID, 2019-0011). Un échantillon de fleur de cannabis libanais (10 g) a été séché à l'air et une extraction à l'éthanol a été réalisée comme décrit précédemment par Shebaby et al. donnant 1,17 g d'extrait d'huile de cannabis brut (COE) 26 . Les composés phytochimiques de la plante libanaise C. sativa ont été séparés par chromatographie sur colonne liquide (LCC). La colonne a fonctionné pendant quatre jours à des vitesses différentes en utilisant une colonne de gel de silice en phase normale et un rapport 4:3:3 de chloroforme, d'hexane et d'éther diéthylique, respectivement, comme phase mobile éluante. Les échantillons ont été collectés dans des tubes à essai et le solvant a été évaporé à l'aide de l'évaporateur rotatif. Ensuite, les échantillons collectés ont été analysés par chromatographie sur couche mince (TLC) qui a été effectuée pour cinq tubes. Le facteur de rétention (R f ) a été calculé en mesurant les distances parcourues à l'aide du logiciel ImageJ et les tubes avec un comportement TLC similaire ont été combinés. Les tubes ont ensuite été évalués par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse à l'aide d'un Shimadzu GCMS-QP2020NX comme décrit précédemment 26 .

La préparation de l'extrait de composés CBD et THC à utiliser sur les cellules cancéreuses a été réalisée en dissolvant 12,5 mg de THC et 37,5 mg de CBD dans de l'éthanol. Après évaporation de l'éthanol à l'aide d'un évaporateur rotatif, le CBD et le THC (3:1) ont ensuite été dissous dans 1 ml de DMSO pour atteindre une concentration finale de 50 mg/ml de solution mère, stockée à -20 °C pour une utilisation ultérieure. La composition et les pourcentages de CBD et de THC dans cette préparation purifiée ont été confirmés (tableau supplémentaire 1 et figure S1) par analyse GC–MS comme décrit précédemment 26 .

Test de viabilité cellulaire

La viabilité de MDA-MB-231 et MCF-7 a été évaluée à l'aide du réactif de viabilité cellulaire MTS (Promega, Wisconsin, États-Unis). Les cellules ont été récoltées, comptées et préparées pour l'ensemencement en triple à une densité de 1 × 10 5 cellules/ml pendant la nuit. Les cellules ont ensuite été traitées avec diverses concentrations de mélange CBD/THC (10, 12,5, 15, 17,5, 20 et 25 μg/ml) pendant 24 et 48 h. Après la période d'incubation souhaitée, le réactif MTS a été utilisé pour quantifier la viabilité cellulaire et déterminer la prolifération cellulaire. Après le retrait du milieu de culture cellulaire, 100 µL de la solution de travail MTS préparée selon les instructions du fabricant ont été ajoutés à chaque puits 28 . Ce test est basé sur l'utilisation du sel de tétrazolium MTS, qui, lorsqu'il est combiné à des cellules métaboliquement actives, entraîne la formation d'un colorant formazan qui peut être détecté à 492 nm à l'aide du lecteur de microplaques multimode Varioskan™ LUX. Les résultats de trois essais distincts sont inclus et la prolifération cellulaire relative a été calculée comme suit :

Analyse de la progression du cycle cellulaire à l'aide d'un cytomètre de flux

Les cellules MDA-MB-231 et MCF-7 ont été ensemencées à une densité de 1 × 10 5 cellules/ml dans des plaques à 6 puits pendant la nuit, puis traitées pendant 24 et 48 h avec 12,5, 15 et 17,5 μg/ml du mélange de cannabinoïdes et 30 µM de cisplatine (Abcam, Cambridge, Royaume-Uni), utilisé comme témoin positif. Après la période d'incubation souhaitée, le milieu de culture a été collecté et les cellules ont été lavées avec du PBS et détachées à l'aide du réactif trypsine-EDTA. Les cellules ont été centrifugées, lavées, fixées avec du PBS glacé et de l'éthanol à 70 % et stockées à − 80 °C pendant la nuit 29 . Les cellules fixées ont été centrifugées le jour suivant, comptées à l'aide d'un hémocytomètre et colorées avec 50 μg/mL d'iodure de propidium (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis) et 0,5 μg/mL de RNase (Roche, Bâle, Suisse) pendant 45 min dans l'obscurité. En utilisant le mode Incyte sur le cytomètre de flux Guava® easyCyteTM (Luminex Corporation, Austin, TX, États-Unis), la teneur en ADN a été évaluée et répartie entre les différentes phases du cycle cellulaire en fonction du degré de liaison PI par rapport au témoin. Les cellules avec une teneur en ADN inférieure à 2n ont été classées dans la phase pré-G0/G1, celles avec une teneur en ADN comprise entre 2 et 4n dans la phase de synthèse (phase S) tandis que les cellules avec une teneur en ADN de 2n et 4n ont été regroupées dans les phases G0/G1 et G2/M, respectivement.

Investigation de l'apoptose à l'aide d'un cytomètre de flux

Les deux lignées cellulaires ont été ensemencées (1 × 10 5 cellules/ml) dans des plaques à 6 puits et traitées avec 12,5, 15 et 17,5 μg/ml de CBD/THC et 30 μM de cisplatine pendant 24 et 48 h. Après la période d'incubation souhaitée, les cellules ont été lavées avec du PBS et détachées avec de la trypsine. Après centrifugation (1 400 g, 5 min et 4 °C), les cellules ont été comptées et colorées pendant 5 min avec la solution de coloration (tampon de liaison 1X, PI 1X et Annexine-V 1X) dans l'obscurité. La cytométrie de flux (Luminex Corporation, Austin, TX, États-Unis) a été utilisée pour obtenir les données (5 000 événements/échantillon) qui ont été analysées à l'aide du mode Incyte sur le logiciel Guava® easyCyteTM. La population cellulaire dans les quatre quadrants a été examinée et définie comme suit : le quadrant inférieur gauche (Ann - /PI - ) désigne les cellules viables, les quadrants inférieur droit (Ann + /PI) et supérieur droit (Ann + /PI + ) représentent les cellules aux stades précoce et tardif de l'apoptose, respectivement, tandis que le quadrant supérieur gauche (Ann - /PI + ) représente les cellules nécrotiques.

Test immuno-enzymatique de détection de la mort cellulaire (ELISA)

Les cellules du cancer du sein ont été plaquées pendant la nuit dans une plaque à 6 puits à une densité de 1 × 10 5 cellules/mL. Le lendemain, les cellules ont été traitées avec 12,5, 15 et 17,5 μg/mL de mélange CBD/THC et 30 μM de cisplatine, dans du milieu frais, pendant une durée de 24 h. Après la période d'incubation souhaitée, et en utilisant le kit ELISA de détection de mort cellulaire (Roche, Bâle, Suisse), une procédure d'immuno-essai enzymatique sandwich a été suivie comme décrit précédemment par El Khoury et al. 30 . Ce test est utilisé pour mesurer les fragments d'ADN associés aux histones cytoplasmiques (mono- et oligo-nucléosomes) libérés dans le cytoplasme des cellules en cours d'apoptose. Conformément aux instructions du fabricant, les cellules ont été collectées, lysées et transférées dans une microplaque pré-revêtue d'anticorps anti-histone à haute spécificité pour les sous-unités d'histone H1, H2A, H2B, H3 et H4. Après un temps suffisant, les puits ont été lavés, puis un anticorps anti-ADN conjugué à une enzyme peroxydase (anti-DNA-POD) qui se lie à l'ADN simple et double brin a été ajouté. Après l'ajout du substrat peroxydase ABTS (2,2'-azino-di-[3-éthylbenzthiazoline sulfonate (6)]), l'absorbance A 405 a été mesurée à l'aide du lecteur de microplaques multimode Varioskan™ LUX, permettant de déterminer l'enzyme peroxydase retenue dans l'immunocomplexe. Les résultats ont été utilisés pour calculer l'enrichissement spécifique des mono- et oligo-nucléosomes libérés dans le cytoplasme des cellules apoptotiques à l'aide de la formule suivante :

Inhibition des caspases à l'aide de Z-VAD-FMK

Les cellules du cancer du sein ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits à une densité de 1 × 10 5 cellules/ml, puis traitées avec un inhibiteur de caspases, Z-VAD-FMK (50 μM) pendant 30 min avant l'ajout du mélange CBD/THC (12,5, 15 et 17,5 μg/ml) pendant 24 et 48 h. Pour évaluer l'effet cytotoxique dépendant des caspases du traitement, le réactif de viabilité MTS a été utilisé comme décrit précédemment pour quantifier les cellules métaboliquement actives par spectrophotométrie à l'aide du lecteur de microplaques multimode Varioskan™ LUX à 492 nm. L'effet de l'inhibition de Z-VAD-FMK sur la prolifération des deux lignées cellulaires a été évalué et comparé aux cellules traitées uniquement avec le mélange CBD/THC.

Inhibition de l'autophagie par la chloroquine et la wortmannine

Les cellules du cancer du sein ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits à une densité de 1 × 10 5 cellules/mL. Pour évaluer la mort cellulaire dépendante de l'autophagie, les cellules du cancer du sein ont été pré-exposées à 50 nM de wortmannine (Wort) ou 10 μM de chloroquine (CQ) pendant 30 min, inhibiteurs de la formation d'autophagosomes et d'autophagolysosomes, respectivement. Les cellules ont ensuite été traitées avec des concentrations croissantes de mélange CBD/THC pendant 24 h, suivies de l'ajout d'un réactif de viabilité MTS, comme détaillé ci-dessus. La viabilité cellulaire a été déterminée en quantifiant la formation de formazan par rapport aux cellules témoins non traitées, qui ont ensuite été comparées aux cellules traitées uniquement avec CBD/THC.

Immunofluorescence

Les cellules du cancer du sein ont été ensemencées à 1 × 10 5 cellules/mL dans des plaques à 6 puits pendant la nuit, puis traitées avec CQ (10 µM), Wort (50 nM), CQ + Wort et CBD/THC (10 et 12,5 µg/mL) avec et sans Wort (50 nM) pendant 24 h. Le lendemain, les cellules ont été préparées pour l'immunofluorescence. Ainsi, les cellules ont été lavées avec du PBS (1X), fixées à l'aide de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % et perméabilisées à l'aide de Triton-X à 0,1 %. Le blocage à l'aide d'albumine sérique bovine (BSA) à 1 % a été effectué pendant 1 h à température ambiante, suivi d'une incubation de l'anticorps primaire (anti-LC3B) pendant la nuit. Le lendemain, un lavage et un anticorps secondaire IgG de chèvre anti-lapin portant Alexa fluor 488 ont été effectués avec une coloration DAPI avant de visualiser les échantillons à l'aide du ZOE Fluorescent Cell Imager 31 .

Essai de cicatrisation des plaies

Pour évaluer les propriétés de migration de lignées cellulaires agressives de cancer du sein après exposition aux cannabinoïdes (CBD et THC), un test de cicatrisation des plaies a été réalisé. Les cellules ont été cultivées pendant la nuit, dans des plaques à 24 puits, à une densité de 2 × 10 5 cellules/mL et ont été autorisées à atteindre une monocouche confluente. Le lendemain, une égratignure à l'aide d'une pointe de micropipette stérile a été réalisée au milieu du puits, créant une zone de plaie. Chaque puits a été lavé doucement avec du PBS pour éliminer les cellules non adhérentes avant d'ajouter du milieu frais avec les différentes concentrations de traitement (IC 50 /4 = 3,125 μg/mL et IC 50 /2 = 6,25 μg/mL). Ces concentrations inférieures à IC 50 ont été utilisées pour confirmer que toute altération de la cicatrisation des plaies reflète des altérations de la migration plutôt que des effets cytotoxiques. À l'aide du microscope à fluorescence ZOE, des images ont été prises à 0 et 24 h après la blessure et les largeurs de plaie ont été analysées à l'aide du logiciel ImageJ. Les données rapportées représentent la moyenne de 3 essais distincts, chacun comprenant des mesures à 16 points différents pour chaque condition expérimentale.

Essais de migration et d'invasion transmembranaires

Pour évaluer plus en détail l'efficacité du mélange CBD/THC sur la motilité des cellules cancéreuses mammaires agressives, des tests de migration et d'invasion ont été réalisés à l'aide de chambres à puits trans (chambre à 24 puits ; taille des pores de 8 μm). Le premier jour, les cellules TNBC ont été cultivées et affamées pendant 24 h dans un milieu incomplet supplémenté de 0,5 % v/v de FBS. Le jour suivant, les cellules ont été collectées et ensemencées dans la partie supérieure de la chambre à puits trans à une densité de 5 × 10 5 cellules/mL dans un milieu sans sérum pour le test de migration ou dans des inserts pré-enduits de Matrigel pour le test d'invasion. Le Matrigel (Corning, NY, États-Unis) a été décongelé sur de la glace à 4 °C, dilué dans un milieu sans sérum (1:4), et enfin 60 µL ont été ajoutés à chaque insert, 1 h avant l'ajout de cellules avec traitement (IC 50 /4 et IC 50 /2). Dans le test de migration, les cellules ont été incubées pendant 24 h tandis que l'évaluation de l'invasion cellulaire a été réalisée après 48 h. Après la période d'incubation souhaitée, les inserts ont été lavés deux fois avec du PBS et un coton-tige a été utilisé pour retirer les cellules restantes de la face supérieure de l'insert. Les cellules de la face inférieure de l'insert ont été fixées avec du PFA (4 %) pendant 2 min, puis perméabilisées avec du méthanol (100 %) pendant 20 min et colorées pendant 15 min avec du DAPI (1 μg/mL). Les membranes ont ensuite été lavées et observées au microscope à fluorescence inversé et plusieurs images de différents champs ont été utilisées pour quantifier le nombre de cellules migratrices et invasives à l'aide du logiciel ImageJ.

Extraction, quantification et préparation des protéines

Pour évaluer l'effet du mélange CBD/THC sur l'expression des protéines régulatrices, les cellules MDA-MB-231 et MCF-7 ont été cultivées dans des boîtes de Petri et laissées pousser pendant la nuit. Le lendemain, les cellules ont été traitées avec un mélange de cannabinoïdes à 12,5, 15 et 17,5 μg/mL. Après 12 ou 24 h, les cellules ont été grattées et lysées à l'aide d'un tampon de lyse préparé avec un cocktail d'inhibiteurs de protéase (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis) et une solution d'EDTA pour empêcher la dégradation protéolytique pendant l'extraction des protéines. Le lysat a été centrifugé à 18 000 g pendant 10 min à 4 °C et le lysat a été aliquoté et stocké à − 80 °C pour une utilisation ultérieure 32 . La quantification des protéines a été réalisée à l'aide des réactifs DC Protein Assay (BioRad, Hercules, CA, États-Unis) en suivant les instructions du fabricant. La solution tampon de Laemmli contenant du β-mercaptoéthanol a été utilisée pour la préparation d'échantillons de protéines (25–50 μg), soumis à 100 °C pendant 10 min avant le chargement dans les gels de polyacrylamide.

Fractionnement cellulaire cytoplasmique

Un fractionnement subcellulaire a été réalisé pour séparer les fractions cellulaires nucléaires, membranaires et cytoplasmiques. Un protocole adapté d'Abcam a été suivi pour réaliser cette extraction de protéines. Les deux lignées cellulaires du cancer du sein ont été ensemencées à une densité de 1 × 10 5 cellules/mL pendant la nuit, puis traitées avec 12,5, 15 et 17,5 μg/mL de CBD/THC pendant 24 h. Après la période d'incubation souhaitée, la lyse cellulaire a été réalisée sur de la glace en utilisant un tampon de fractionnement préparé avec des inhibiteurs de protéase. Les cellules ont ensuite été grattées et centrifugées à 2800 g pendant 5 min. Le surnageant contenant les fractions cytoplasmiques, mitochondriales et membranaires a été centrifugé à nouveau à 13 600 g (5 min), permettant la séparation de la fraction mitochondriale dans le culot de la fraction cytoplasmique dans le surnageant 33 , 34 . Chaque fraction a été collectée et quantifiée à l'aide des réactifs DC Protein Assay. Les protéines ont été préparées dans une solution tampon de Laemmli contenant du β-mercaptoéthanol, puis dénaturées à 100 °C pendant 10 min avant d'être chargées dans les gels de polyacrylamide.

Analyse Western blot

L'effet du mélange CBD et THC sur l'expression des protéines a été évalué dans les deux lignées cellulaires, par Western Blotting. Des échantillons de protéines ont été chargés sur le gel pour être séparés par électrophorèse sur gel de dodécyl sulfate de sodium–polyacrylamide (SDS-PAGE). Les protéines ont ensuite été transférées sur des membranes de polyfluorure de vinylidène (PVDF) qui ont ensuite été bloquées dans une solution de BSA à 5 % pendant 1 h à température ambiante, puis incubées avec l'anticorps primaire, pendant la nuit à 4 °C 35 . Tous les anticorps primaires ont été dilués selon les recommandations du fabricant dans une solution tampon de blocage comme suit : 1:3000 anti-β-Actine (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, États-Unis) utilisé comme contrôle de chargement, et 1:1000 anti-Bax, anti-Bcl2, anti-PAPRP clivé, anti-cytochrome c, anti-caspase 3 clivée, anti-beclin1, anti-LC3B, anti-MMP2 et anti-MMP9. Les membranes ont ensuite été lavées et incubées avec un anticorps secondaire conjugué à la HRP (BioRad, Hercules, CA, USA) pendant 1 h à température ambiante 36 . Les substrats de chimioluminescence Clarity Western ECL (BioRad, Hercules, CA, USA) ont été utilisés pour détecter l'expression des protéines par la révélation d'images de transfert à l'aide de l'instrument d'imagerie ChemiDoc. Le logiciel ImageJ a été utilisé pour l'analyse quantitative des bandes de protéines cibles normalisées par rapport au contrôle de la β-actine endogène.

Détection des espèces réactives de l'oxygène

Des lignées cellulaires de cancer du sein ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits à une densité de 2 × 10 5 cellules/mL et laissées adhérer pendant la nuit. Le jour suivant, les cellules MDA-MB-231 et MCF-7 ont été traitées pendant 45 min avec 25 μM de diacétate de 2',7'-dichlorodihydrofluorescéine (H 2 DCFDA) perméable aux cellules selon la recommandation du fabricant (Abcam, Cambridge, Royaume-Uni). Après le temps d'incubation souhaité, les cellules ont été lavées et traitées avec 12,5, 15 et 17,5 μg/mL de mélange CBD/THC dilué dans des milieux de culture sans rouge de phénol pendant 2 h et 24 h. Le peroxyde d'hydrogène (H 2 O 2 ) a été utilisé comme inducteur puissant de ROS et la NAC, un puissant inhibiteur de ROS, a été utilisée. La conversion oxydative du H 2 DCFDA en sa 2′,7′-dichlorofluorescéine (DCF) hautement fluorescente en présence de ROS a été quantifiée à l'aide du lecteur de microplaques multimode fluorométrique Varioskan™ LUX 37 .

Analyse statistique

Toutes les données rapportées représentent la valeur moyenne ± l'écart type de trois essais indépendants pour chaque expérience. Les analyses statistiques ont été réalisées à l'aide de GraphPad Prism8 en calculant la valeur p à l'aide de tests t, d'ANOVA à un ou deux facteurs selon l'expérience. GraphPad Prism8 a été utilisé pour la préparation des figures. Toutes les différences significatives ont été rapportées comme suit : * indiquant une valeur p : 0,01 < p < 0,05, ** indiquant une valeur p : 0,001 < p < 0,01, et *** indiquant une valeur p : 0,0001 < p < 0,001.

Résultats
Un mélange de cannabinoïdes inhibe la prolifération des lignées cellulaires du cancer du sein en favorisant la fragmentation cellulaire

Nous avons étudié l'efficacité de deux composés majeurs isolés de la plante libanaise C. sativa , le CBD et le THC, sur la viabilité et la prolifération des lignées cellulaires du cancer du sein. Le test de cytotoxicité a été réalisé à l'aide du réactif MTS. Comme indiqué dans la Fig. 1 , le mélange CBD/THC (3:1) a montré une inhibition significative de la prolifération de MDA-MB-231 et MCF-7 de manière dépendante de la dose et du temps. Après 24 et 48 h, les deux lignées cellulaires ont montré une diminution progressive de la valeur d'absorption (A 492 ) lors du traitement par rapport aux cellules non traitées.

Une diminution significative de la prolifération de MDA-MB-231 a été déterminée atteignant 86,4 %, 63,57 % et 31,37 % à 12,5, 15 et 17,5 μg/mL, respectivement 24 h après le traitement, tout en rapportant un effet significativement plus élevé après 48 h de traitement atteignant 43,2 %, 17,79 % et 8,4 % à 12,5, 15 et 17,5 μg/mL, respectivement (Fig. 1 A). Les concentrations inhibitrices demi-maximales (CI 50 ) sur les cellules MDA-MB-231 sont de 16,18 μg/mL à 24 h et de 12,12 μg/mL à 48 h de traitement. Français Cependant, un effet plus léger mais significatif a été observé sur la lignée cellulaire MCF-7, montrant une diminution de la prolifération cellulaire atteignant 77,11 %, 71,99 % et 62,6 % après 24 h et 56,51 %, 49,80 % et 30,57 % après 48 h de traitement avec 12,5, 15 et 17,5 μg/mL, respectivement (Fig. 1 B). Le mélange de CBD et de THC s'est avéré présenter un effet inhibiteur sensiblement plus élevé sur la prolifération des cellules par rapport aux composés individuels à des concentrations comparables au mélange (Fig. 2 A et B supplémentaires). Les concentrations IC 50 sont de 19,43 μg/mL après 24 h et de 13,62 μg/mL après 48 h de traitement. Ainsi, nos résultats indiquent un effet antiprolifératif dépendant de la dose et du temps sur les deux lignées cellulaires du cancer du sein, les cellules MDA-MB-231 et MCF-7. Sur la base de ces résultats, des expériences ultérieures ont été réalisées en utilisant des concentrations de mélange CBD/THC (12,5, 15 et 17,5 μg/mL) les plus proches de la CI 50 à 24 et 48 h sur les deux lignées cellulaires.

Fig. 1
figure 1
Dosage de la cytotoxicité des cellules MDA-MB-231 ( A ) et MCF-7 ( B ) traitées avec un mélange CBD/THC (10, 12,5, 15, 17,5, 20 et 25 μg/mL) pendant 24 et 48 h. Les données représentent la moyenne ± écart type de trois expériences indépendantes. La signification statistique indiquée par * correspond à une valeur p < 0,05, ** correspond à une valeur p < 0,01 et *** correspond à une valeur p < 0,001.

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Fig. 2
figure 2
Analyse du cycle cellulaire des cellules MDA-MB-231 ( A – D ) et MCF-7 ( E – H ) traitées avec du CBD/THC (12,5, 15, 17,5 μg/mL) pendant 24 h et 48 h. Les données représentent la moyenne ± écart type de trois expériences indépendantes. La signification statistique indiquée par * correspond à une valeur p < 0,05, ** correspond à une valeur p < 0,01 et *** correspond à une valeur p < 0,001.

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L'analyse du cycle cellulaire des cellules MDA-MB-231 et MCF-7 en réponse au traitement CBD/THC a ensuite été réalisée en évaluant la teneur en ADN à l'aide du cytomètre de flux conformément à l'affinité de liaison PI. Le mélange de cannabinoïdes a diminué de manière significative la teneur en G0-G1 (ADN = 2n), S (2n < ADN < 4n) et G2/M (ADN = 4n) tout en augmentant la teneur en pré-G (ADN < 2n) dans les deux lignées cellulaires de manière dépendante de la dose et du temps (Fig. 2 ). Ce mélange a diminué de manière significative la teneur en G0-G1 dans les cellules MDA-MB-231 de 38,7 % dans les cellules témoins à 16,26 % à 24 h et de 38,76 % à 18,86 % à 48 h de traitement à 17,5 μg/mL. Parallèlement à cela, une augmentation significative de la sous-population pré-G a été observée, passant de 8,32 % et 9,17 % dans les cellules témoins à 59,86 % et 67,96 % avec un traitement de 17,5 μg/mL à 24 et 48 h, respectivement (Fig. 2 C et D). L'effet du traitement sur la progression du cycle cellulaire MCF-7 était plus faible par rapport à la lignée cellulaire MDA-MB-231. Français Les données ont montré une diminution significative de 57,10 % (24 h) et 51,46 % (48 h) dans les cellules témoins à 44,09 % (24 h) et 40,63 % (48 h) à 17,5 μg/mL dans la teneur en G0-G1 tout en montrant une augmentation significative de la teneur en pré-G de 8,05 % (24 h) et 14,98 % (48 h) dans les cellules témoins atteignant 29,22 % (24 h) et 33,78 % (48 h) à la concentration la plus élevée de traitement (17,5 μg/mL) (Fig. 2 G et H). Nos données suggèrent que le mélange CBD/THC inhibe la prolifération des cellules cancéreuses du sein en favorisant la fragmentation cellulaire plutôt qu'en induisant un arrêt du cycle cellulaire.

Un mélange de cannabinoïdes favorise l'activation du mécanisme de mort cellulaire apoptotique dans les cellules cancéreuses du sein

Pour déterminer si le mélange de CBD et de THC favorise l'activation du mécanisme de mort cellulaire apoptotique programmée, les cellules MDA-MB-231 et MCF-7 ont été traitées avec 12,5, 15 et 17,5 μg/mL de CBD et de THC pendant 24 et 48 h et analysées par cytométrie de flux après une double coloration à l'annexine V et à l'IP. Comme le montre la Fig. 3 , une augmentation dose-dépendante et temporelle des cellules apoptotiques a été observée dans les deux lignées cellulaires. Les cellules TNBC ont montré une diminution significative du pourcentage de cellules viables (Ann - /IP - ) de 87,97 % dans les cellules témoins à 39,37 % après exposition à 17,5 μg/mL ainsi qu'une augmentation significative du pourcentage total de cellules apoptotiques (Ann + /IP - et Ann + /IP + ) de 9,59 % à 52,02 % à la concentration la plus élevée de traitement (Fig. 3 A). Français L'effet était sensiblement plus élevé après 48 h de traitement, où les résultats ont montré une diminution significative de 89,63 % à 39,81 % des cellules viables (Ann - /PI - ) et une augmentation significative de 7,70 % à 47,16 % des cellules apoptotiques (Ann + /PI - et Ann + /PI + ) à 17,5 μg/mL de traitement CBD/THC (Fig. 3 B). D'autre part, les résultats sur les cellules MCF-7 ont montré une diminution du pourcentage de cellules viables (Ann - /PI - ) de 85,75 % à 68,63 % couplée à une augmentation du nombre total de cellules apoptotiques (Ann + /PI - et Ann + /PI + ) de 10,12 % à 20,63 % à 17,5 μg/mL par rapport aux cellules témoins (Fig. 3 C). Français Un effet plus important a été observé après 48 h de traitement comme le montre la diminution significative des cellules viables (Ann - /PI - ) de 82,82 % à 51,69 % ainsi qu'une augmentation significative de la population totale de cellules apoptotiques (Ann + /PI - et Ann + /PI + ) de 13,16 % à 39,17 % après exposition à 17,5 μg/mL de CBD/THC (Fig. 3 D). Nos résultats démontrent l'effet prometteur de ce mélange de cannabinoïdes sur la promotion de l'apoptose dans les lignées cellulaires MDA-MB-231 et MCF-7 de manière dépendante de la dose et du temps.

Fig. 3
figure 3
Dosage de l'apoptose par double coloration à l'annexine V/PI dans le MDA-MB-231 ( A – B ) et le MCF-7 ( C – D ) après 24 h et 48 h de traitement avec un mélange CBD/THC (12,5, 15, 17,5 μg/mL). Les données représentent la moyenne ± écart type de trois expériences indépendantes. La signification statistique indiquée par * correspond à une valeur p < 0,05, ** correspond à une valeur p < 0,01 et *** correspond à une valeur p < 0,001.

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Pour explorer davantage l'activité pro-apoptotique puissante du mélange CBD/THC sur les lignées cellulaires du cancer du sein, la fragmentation de l'ADN, une caractéristique majeure de l'apoptose, a été quantifiée à l'aide de la méthode ELISA. Les deux lignées cellulaires ont montré une augmentation significative de l'enrichissement des fragments d'ADN tout en augmentant la concentration du traitement aux cannabinoïdes. Les cellules MDA-MB-231 ont signalé une augmentation significative atteignant 3,76, 9,48 et 11,64 lors d'une exposition à 12,5, 15 et 17,5 μg/mL de traitement, respectivement. L'effet s'est avéré plus élevé que le contrôle positif utilisé, le cisplatine (30 µM) dans ce cas (Fig. 4 A). Le mélange CBD et THC a montré des effets similaires sur les cellules MCF-7, avec une augmentation du facteur d'enrichissement atteignant 2,1, 3,93 et ​​4,77 à 12,5, 15 et 17,5 μg/mL de traitement, respectivement. Français Le cisplatine, utilisé comme contrôle positif, a montré un effet similaire au traitement au CBD et au THC sur la fragmentation de l'ADN dans cette lignée cellulaire (Fig. 4 B). Au niveau moléculaire, la fragmentation de l'ADN a été évaluée plus en détail par analyse du clivage de PARP via Western blot (Fig. 4 C). Le traitement aux cannabinoïdes a induit une augmentation significative de l'expression de PARP clivée dans les deux lignées cellulaires du cancer du sein, atteignant une augmentation de 2 et 3,5 fois à la concentration la plus élevée de traitement (17,5 μg/mL) dans les cellules MDA-MB-231 et MCF-7, respectivement (Fig. 4 D–E). Ces résultats ont confirmé l'effet prometteur du mélange de cannabinoïdes sur la promotion de la fragmentation de l'ADN dans les cellules MDA-MB-231 et MCF-7, une caractéristique majeure de l'apoptose.

Fig. 4
figure 4
Détection de fragmentation de l'ADN dans MDA-MB-231 ( A ) et MCF-7 ( B ) par ELISA de détection de mort cellulaire après 24 h de traitement (12,5, 15, 17,5 μg/mL). Analyse par transfert Western des protéines PARP dans les deux lignées cellulaires ( C ), ainsi que la quantification dans les cellules MDA-MB-231 ( D ) et MCF-7 ( E ). Les données représentent la moyenne ± écart type de trois expériences indépendantes. La signification statistique indiquée par * correspond à une valeur p < 0,05, ** correspond à une valeur p < 0,01 et *** correspond à une valeur p < 0,001.

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Pour déchiffrer les voies moléculaires par lesquelles le mélange de cannabinoïdes inhibe la prolifération des lignées cellulaires du cancer du sein, une analyse par transfert Western des marqueurs apoptotiques régulateurs a été réalisée. L'expression des principales protéines impliquées dans l'activation ou la répression de la voie apoptotique a été évaluée. L'expression de la protéine pro-apoptotique Bax n'a pas été altérée et est restée constante tandis que l'expression de la protéine anti-apoptotique Bcl-2 a été significativement réduite par rapport au témoin dans les deux lignées cellulaires traitées avec CBD/THC (Fig. 5 ). Le rapport de Bax à Bcl2 a été calculé et s'est avéré augmenter significativement en fonction de la dose dans les deux lignées cellulaires. Les données ont montré une augmentation de 1,7 fois des cellules MCF-7 et de 5 fois des cellules MDA-MB-231 lors du traitement avec la concentration la plus élevée de CBD et de THC (17,5 μg/mL) (Fig. 5 B–C). Ces résultats révèlent l'activité pro-apoptotique prometteuse des composés du cannabis sur les cellules cancéreuses du sein via l'activation de la voie dépendante des mitochondries. Pour confirmer davantage l'activation de la voie apoptotique intrinsèque, la libération de cytochrome c dans le cytosol a été évaluée. Ainsi, nous avons cherché à évaluer l'expression du cytochrome c isolé des fractions protéiques totales et cytosoliques via l'immunoblotting Western. Aucun changement significatif dans l'expression totale du cytochrome c n'a été observé dans les deux lignées cellulaires. Cependant, le fractionnement subcellulaire a révélé l'augmentation de l'expression cytosolique du cytochrome c dans MCF-7 (augmentation de 15 fois) et MDA-MB-231 (augmentation de 3,5 fois) (Fig. 5 B–C). La libération de cytochrome c dans le cytoplasme soutient en outre l'activation de la voie apoptotique dépendante des mitochondries.

Fig. 5
figure 5

Évaluation moléculaire de l'apoptose par analyse Western blot des marqueurs régulateurs de l'apoptose dans les cellules MDA-MB-231 ( A – B ) et MCF-7 ( A & C ) traitées pendant 24 h avec du CBD/THC (12,5, 15, 17,5 μg/mL). Dosage de la viabilité cellulaire à l'aide du réactif MTS après traitement au CBD/THC seul ou en association avec un inhibiteur des caspases, Z-VAD-FMK (50 μM) pendant 24 et 48 h dans les cellules MDA-MB-231( D ) et MCF-7 ( E ). Évaluation de la production de ROS dans les cellules MDA-MB-231 et MCF-7 ( F ) après 2 et 24 h de traitement au CBD/THC. Les données représentent la moyenne ± l'écart type de trois expériences indépendantes. La signification statistique rapportée comme * correspond à une valeur p < 0,05, ** correspond à une valeur p < 0,01 et *** correspond à une valeur p < 0,001.

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L'activation de la voie apoptotique d'exécution par le clivage de la caspase-3 a été évaluée pour confirmer davantage l'effet important des cannabinoïdes sur la promotion de l'apoptose dans les cellules cancéreuses du sein. L'analyse par transfert Western a révélé une expression régulée à la hausse constante de la caspase-3 clivée après 24 h de traitement. Une augmentation significative de l'expression de la caspase 3 clivée dans les deux lignées cellulaires du cancer du sein a été notée, atteignant une augmentation de 2,5 et 15,52 fois à la concentration la plus élevée de traitement (17,5 μg/mL) dans les cellules MDA-MB-231 et MCF-7, respectivement (Fig. 5 B–C). Ces résultats démontrent l'activité pro-apoptotique du mélange CBD/THC telle que révélée par l'activation de l'apoptose via la voie d'exécution. De plus, l'inhibiteur de la caspase, Z-VAD-FMK, a été utilisé pour déterminer davantage le rôle des caspases dans la promotion de la mort cellulaire. Français Par conséquent, le test MTS a été effectué sur les deux lignées cellulaires prétraitées avec Z-VAD pendant 30 min, suivi de l'ajout d'un mélange CBD/THC pendant 24 et 48 h. La viabilité des cellules MDA-MB-231 a diminué de manière significative, atteignant 28 % après traitement avec 17,5 μg/mL de CBD/THC. Cependant, la viabilité cellulaire s'est avérée significativement plus élevée, atteignant environ 80 %, lorsque les cellules TNBC ont été traitées pendant 24 h avec Z-VAD en combinaison avec 17,5 μg/mL de CBD/THC (Fig. 5 D). En revanche, le traitement Z-VAD n'a pas affecté la réponse des cellules MCF-7 au traitement aux cannabinoïdes pendant 24 h. Le test de viabilité cellulaire a révélé une diminution du pourcentage de viabilité des cellules MCF-7 atteignant 60 % lorsqu'elles étaient traitées avec des cannabinoïdes seuls ou en combinaison avec Z-VAD (Fig. 5 E). Cependant, un effet significativement plus élevé du Z-VAD sur l'inversion de l'effet antiprolifératif du mélange de cannabinoïdes dans les cellules MDA-MB-231 et MCF-7 a été observé, atteignant respectivement 88 % et 57 % de viabilité, contre 14 % et 33 % de viabilité lorsqu'elles étaient traitées avec 17,5 μg/mL de cannabinoïdes seuls. Ces résultats étayent davantage nos conclusions précédentes démontrant l'activation de l'apoptose de manière dépendante de la caspase, via le début de la voie apoptotique d'exécution.

Pour déterminer si l'activation de la voie apoptotique intrinsèque dans ce cas était due au stress oxydatif, un test DCFDA a été réalisé pour quantifier la production de ROS dans les cellules MDA-MB-231 et MCF-7 exposées au traitement aux cannabinoïdes. Les cellules TNBC ont montré une diminution faible mais significative des niveaux de ROS après une exposition de 2 heures au mélange de cannabinoïdes, atteignant 0,6 fois après un traitement avec la concentration la plus élevée de mélange CBD/THC (17,5 μg/mL). Cependant, les niveaux instantanés de production de ROS se sont avérés modérément diminués dans les cellules MCF-7 après 2 heures de traitement, atteignant environ 0,75 fois. Par conséquent, nous avons cherché à évaluer l'effet dépendant du temps du mélange CBD/THC sur l'inhibition de la production de ROS après 24 heures de traitement. Nos résultats ont montré une inhibition accrue de la production de ROS dans les lignées cellulaires MDA-MB-231 et MCF-7 de manière dose-dépendante. Une diminution significative de la production de ROS a été observée, atteignant 0,17 dans les cellules MDA-MB-231 et 0,2 dans les cellules MCF-7 après exposition à 17,5 μg/mL pendant 24 h (Fig. 5 F). Nos résultats ont été comparés à ceux de l'inhibiteur puissant des ROS, la NAC, et de l'inducteur des ROS H2O2 utilisés sur les deux lignées cellulaires. L'inhibition dose-dépendante et temporelle de la formation des ROS démontre les propriétés antioxydantes de ce traitement , suggérant que l'activation de la voie apoptotique intrinsèque ne dépend pas du stress oxydatif, mais plutôt de stimuli internes responsables de son activation.

Un mélange de cannabinoïdes favorise l'altération du rôle régulateur de l'autophagie dans les cellules cancéreuses du sein

Pour mieux comprendre si le mélange de CBD et de THC peut favoriser l'activation d'un autre mécanisme de mort cellulaire, un immunoblot Western des principaux marqueurs autophagiques, à savoir LC3B et Beclin-1, a été réalisé. Nos résultats ont montré une augmentation significative du niveau d'expression de la protéine liée à la membrane de l'autophagosome, LC3B, dans les cellules cancéreuses du sein après traitement au CBD/THC pendant 24 h (Fig. 6 ). La quantification de LC3B a révélé une expression multipliée par sept et par quatre dans les cellules MDA-MB-231 et MCF-7, respectivement. Cependant, nos résultats ont montré une diminution significative dose-dépendante du niveau d'expression de Beclin-1 dans les deux lignées cellulaires du cancer du sein. La quantification des buvards a montré une expression diminuée atteignant 0,5 dans les cellules MDA-MB-231 et 0,7 dans les cellules MCF-7 après traitement avec un mélange de cannabinoïdes. De plus, l'expression des protéines LC3B, Beclin-1 et caspase 3 clivée a également été évaluée après 12 h de traitement pour évaluer les altérations dépendantes du temps de l'autophagie. Notre analyse Western blot a révélé une augmentation significative de 1,5 fois de l'expression de LC3B dans les cellules MDA-MB-231 et MCF-7 tout en favorisant une expression régulée à la baisse de Beclin-1 atteignant 0,8 et 0,5 dans MDA-MB-231 et MCF-7, respectivement. L'expression de la caspase 3 clivée a également été évaluée 12 h après le traitement et s'est avérée être significativement régulée à la hausse dans les deux lignées cellulaires, confirmant ainsi une activation plus précoce de l'apoptose. Compte tenu de l'augmentation constante de LC3B observée, nous avons cherché à déterminer si l'autophagie est responsable de la mort des cellules cancéreuses du sein ; par conséquent, un test de cytotoxicité a été réalisé après le traitement des cellules cancéreuses du sein avec le mélange de cannabinoïdes seul ou en association avec des inhibiteurs de l'autophagie, CQ ou Wort. Un test MTS a été réalisé et aucun effet significatif n'a été observé entre les cellules traitées avec CBD/THC seul ou en combinaison avec CQ pendant 24 h. La viabilité des cellules MDA-MB-231 a atteint 27 % après traitement avec 17,5 μg/mL de mélange CBD/THC et 30 % après traitement avec CBD/THC et CQ pendant 24 h. De même, la viabilité des cellules MCF-7 a diminué pour atteindre 61 % et 65 % après traitement avec le mélange CBD/THC seul et en combinaison avec CQ, respectivement (Fig. 6 D). Étant donné que la CQ inhibe les dernières étapes de l'autophagie, à savoir le flux autophagique, nous avons ensuite cherché à évaluer l'effet du millepertuis, un inhibiteur des premières étapes de l'autophagie. Nos résultats n'ont révélé aucun effet d'inversion lors de l'exposition des cellules cancéreuses du sein aux cannabinoïdes seuls ou en combinaison avec du millepertuis, atteignant respectivement 44 % et 46 % de viabilité, ce qui confirme donc nos résultats précédents utilisant CQ (Fig. 6E). Pour confirmer davantage la capacité du millepertuis à réduire la formation de complexes nécessaires à la formation de phagophores, une évaluation visuelle a été réalisée par immunofluorescence à l'aide d'un anticorps LC3B. Les images microscopiques ont révélé la capacité du millepertuis à inverser l'effet de la CQ, comme l'observe l'accumulation réduite d'autophagosomes dans le cytosol. L'immunomarquage a également montré une accumulation encore plus prononcée d'autophagosomes dans le cytosol des cellules traitées avec du CBD/THC par rapport aux cellules traitées avec du CQ seul. En prenant ces résultats ensemble, nous pouvons suggérer que le mélange CBD/THC favorise la mort cellulaire via l'activation de l'apoptose plutôt que l'autophagie tout en agissant également comme un inhibiteur du flux autophagique dans les cellules cancéreuses du sein.

Fig. 6
figure 6
Évaluation moléculaire de l'autophagie par analyse Western blot des marqueurs liés à l'autophagie dans les cellules MDA-MB-231 ( A – C ) et MCF-7 ( A et G – H ) traitées pendant 12 ( C et H ) et 24 h ( B et G ) avec du CBD/THC. Dosage de la viabilité cellulaire à l'aide du réactif MTS après traitement au CBD/THC seul ou en association avec des inhibiteurs de l'autophagie, CQ (10 μM) ( E ) et Wort (50 nM) ( F ) pendant 24 h dans les cellules MDA-MB-231 et MCF-7. Coloration par immunofluorescence du MDA-MB-231 avec l'anticorps LC3B après traitement pendant 24 h avec du CBD/THC ( F ). Les données représentent la moyenne ± écart type de trois expériences indépendantes. La signification statistique rapportée comme * correspond à une valeur p < 0,05, ** correspond à une valeur p < 0,01 et *** correspond à une valeur p < 0,001.

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Le mélange de cannabinoïdes présente des propriétés anti-métastatiques en inhibant les capacités migratoires et invasives des cellules TNBC

D'un autre point de vue, nous avons cherché à évaluer les propriétés anti-métastatiques du CBD et du THC sur le type de cancer du sein le plus agressif, à savoir les cellules TNBC. Des tests de cicatrisation des plaies et de migration et d'invasion trans-puits ont été réalisés. Dans le test de cicatrisation des plaies, les cellules TNBC ont été co-cultivées avec de faibles doses de mélange CBD/THC (IC 50/4 et IC 50/2 ) sachant qu'elles présentent un léger effet sur la viabilité cellulaire, suite à la formation de rayures. La Fig. 7 montre des images des points temporels 0 et 24 h ainsi que les résultats de quantification de la fermeture de la plaie (Fig. 7 A). Nos résultats ont montré que le mélange de cannabinoïdes inhibait significativement la migration des cellules MDA-MB-231 à travers l'espace de la plaie après 24 h, par rapport aux cellules témoins. Français Une augmentation significative de la largeur de la plaie a été observée lors de l'exposition des cellules MDA-MB-231 à 6,25 μg/mL (IC 50 /2) de CBD/THC pendant 24 h. Pour confirmer davantage les résultats du test de cicatrisation des plaies, un test de migration trans-puits a été réalisé. Nos résultats suggèrent qu'après 24 h de traitement, la motilité des cellules TNBC était significativement inhibée comme le révèle la diminution importante du nombre de cellules migrées par rapport aux cellules non traitées (Fig. 7 B). Une diminution significative des cellules migrées a été constatée atteignant 0,8 et 0,2 lors d'une exposition à 3,12 et 6,25 μg/mL, respectivement. D'autre part, nous avons testé l'effet inhibiteur du mélange CBD/THC sur l'inhibition de l'invasion cellulaire à travers une couche de Matrigel qui ressemble à l'environnement extracellulaire. Nos données ont révélé un effet inhibiteur significatif du mélange de ce cannabinoïde sur les capacités invasives des cellules MDA-MB-231 après un traitement CBD/THC (6,25 μg/mL) pendant 48 h, atteignant 0,3 fois (Fig. 7 C). L'effet anti-métastatique a été davantage élucidé au niveau moléculaire, comme le révèle la capacité du CBD/THC à réguler à la baisse l'expression des métalloprotéinases matricielles (MMP) (Fig. 7 D). Nos données ont montré une expression régulée à la baisse significative de MMP2 et MMP9, atteignant respectivement 0,6 et 0,5 lors d'une exposition à 17,5 μg/mL de CBD/THC. En prenant ces résultats ensemble, nous pouvons conclure que le mélange CBD/THC présente un effet inhibiteur sur la capacité métastatique des cellules TNBC.

Fig. 7
figure 7
Évaluation des propriétés anti-métastatiques du CBD/THC sur les cellules TNBC. Essai de cicatrisation des plaies ( A ), essais de migration trans-puits ( B ) et d'invasion ( C ). Évaluation moléculaire des protéines régulatrices de la motilité après 24 h de traitement au CBD/THC (3,12 et 6,25 μg/mL) ( D ). Les données représentent la moyenne ± écart type de trois expériences indépendantes. La signification statistique rapportée comme * correspond à une valeur p < 0,05, ** correspond à une valeur p < 0,01 et *** correspond à une valeur p < 0,001.

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Discussion

Les humains ont traditionnellement utilisé les plantes à diverses fins comme un réservoir illimité de molécules bioactives qui jouent un rôle thérapeutique dans le traitement de plusieurs maladies, y compris la progression tumorale. Depuis le début de la civilisation humaine, Cannabis sativa L. a été utilisé à la fois à des fins récréatives et thérapeutiques 1 , 38 . De nombreuses études menées récemment ont découvert une large gamme de composés naturels, à savoir le CBD et le THC, qui ciblent sélectivement les cellules cancéreuses tout en épargnant les cellules saines des dommages. Des recherches approfondies ont été menées au cours des vingt dernières années pour explorer les perspectives cliniques et biologiques des cannabinoïdes, seuls ou en combinaison, dans le traitement de diverses maladies, dont le cancer. Récemment, Schoeman et al., ont cherché à étudier les propriétés antiprolifératives des plantes de cannabis médicinales (à forte teneur en CBD) et récréatives (à forte teneur en THC) sur deux lignées cellulaires différentes de cancer du sein, les cellules MDA-MB-231 et MCF-7 20 . Compte tenu de leurs résultats prometteurs, nous avons cherché à identifier dans l'étude actuelle le mécanisme anticancéreux de ces cannabinoïdes isolés de la souche libanaise C. sativa . Ainsi, un mélange de CBD et de THC (3:1) dans des ratios comparables à la plante médicinale libanaise a été utilisé pour élucider le mécanisme d'action dans les cellules cancéreuses du sein, sachant qu'une telle formulation s'est avérée inhiber sélectivement la prolifération des cellules MDA-MB-231 et MCF-7 sans effet indésirable sur les cellules normales 20 , 26 .

L'effet important des principaux composés de C. sativa , le CBD et le THC, a déjà été établi sur divers types de cancer. Il a été précédemment rapporté que le cannabidiol non psychoactif (CBD) inhibait la croissance des cellules cancéreuses du sein, du gliome, de la leucémie, du poumon et du côlon 39 , 40 . De même, diverses études sur le THC ont révélé son effet cytotoxique sur les cancers du sein, de la leucémie, du poumon, hépatocellulaire et de la prostate 15 , 41 , 42 . Nos résultats démontrent que la combinaison des deux cannabinoïdes les plus abondants, à savoir le CBD et le THC, présente un effet inhibiteur sensiblement plus élevé sur les cellules cancéreuses du sein par rapport à l'effet des composés individuels. Cela est conforme aux études précédentes rapportant l'effet synergique de la combinaison du CBD et du THC sur les cellules du poumon et du glioblastome 17 , 43 . Français Le mélange de CBD et de THC en quantités égales (1:1) s'est avéré avoir un effet antiprolifératif sur les cellules leucémiques en augmentant leur sensibilité à la cytarabine et à la vincristine 19 , tandis que plus récemment, une étude sur des souches à forte teneur en THC et en CBD a révélé une inhibition notable de la viabilité des cellules cancéreuses du sein 20 . Ces résultats ont été confirmés dans notre étude, où un mélange à forte teneur en CBD et en THC (3:1) a révélé un effet antiprolifératif significatif de manière dose-dépendante et temporelle sur les cellules MDA-MB-231 et MCF-7. Il est intéressant de noter que les cannabinoïdes se sont avérés auparavant avoir un effet inhibiteur sélectif sur les cellules cancéreuses sans affecter la croissance des cellules saines 44 . Une étude menée par Shrivastava et al. ont montré que le CBD présente un effet sélectif sur les cellules cancéreuses sans activité cytotoxique sur les cellules mammaires normales, à savoir MCF-10A 45 , similaire à d'autres études évaluant le composé THC et révélant son effet protecteur sur les cellules normales 10 , 46 . Il a été suggéré précédemment que l'expression différentielle des récepteurs cannabinoïdes à la surface des cellules cancéreuses et normales, pourrait être une explication possible de leur effet sélectif sur les cellules cancéreuses tout en protégeant les cellules normales de leur activité cytotoxique et apoptotique 47 . Sur la base de l'effet important dépendant de la dose et du temps rapporté dans cette étude sur les deux lignées cellulaires, des expériences ultérieures ont été réalisées en utilisant des concentrations de mélange CBD/THC qui sont les plus proches de la CI 50 à 24 et 48 h sur les cellules MDA-MB-231 et MCF-7.

Une série d'expériences a été réalisée pour déchiffrer les mécanismes moléculaires activés dans les cellules cancéreuses du sein exposées au mélange de cannabinoïdes. Nous souhaitions déterminer si cet effet est dû à l'arrêt du cycle cellulaire, en utilisant la cytométrie de flux. Notre analyse de la progression du cycle cellulaire a montré une régulation positive significative de la fragmentation cellulaire des cellules MDA-MB-231 et MCF-7, comme le révèle l'augmentation constante de la sous-population pré-G. Cela est conforme aux études précédentes évaluant le rôle du traitement unique au CBD ou du cotraitement avec le THC dans l'induction de la mort cellulaire plutôt que de l'arrêt du cycle cellulaire dans les lignées cellulaires cervicales et du myélome multiple, respectivement 48 , 49 . Ces études parmi plusieurs autres révèlent que l'activité anticancéreuse du mélange CBD/THC est directement associée à l'activation d'un mécanisme de mort cellulaire programmée. Ainsi, nous avons émis l'hypothèse que la mort cellulaire observée dans notre étude pourrait être due à l'activation de l'apoptose. Français Pour déterminer si ce mécanisme est effectivement activé et responsable de cet effet, une analyse par cytométrie de flux de cellules doublement colorées à l'annexine V et à l'iodure de propidium a été réalisée. Nos données suggèrent une augmentation significative du pourcentage de cellules apoptotiques (Ann + et PI +/- ) confirmant que le mélange CBD/THC favorise l'activation de l'apoptose dans les lignées cellulaires du cancer du sein. De plus, l'évaluation de la fragmentation de l'ADN pourrait fournir une confirmation supplémentaire de l'induction de l'apoptose, puisque l'activité des endonucléases favorise le clivage de l'ADN chromosomique en fragments oligonucléosomiques qui pourraient être détectés via la méthode ELISA 50 . Dans notre étude, une augmentation significative de l'enrichissement des oligomères d'ADN a été observée dans les deux lignées cellulaires, confirmant l'activité pro-apoptotique du CBD et du THC sur les cellules MDA-MB-231 et MCF-7, in vitro. Des études antérieures ont rapporté un effet pro-apoptotique similaire des cannabinoïdes sur différents types de cancer, révélé par la translocation de la phosphatidylsérine vers la membrane externe des cellules cancéreuses du sein et l'induction de la fragmentation de l'ADN dans les cellules cancéreuses gastriques 45 , 51 . Ces caractéristiques sont le résultat de protéines régulatrices qui ont permis l'activation de l'apoptose, qui s'est avérée être dans cette étude le principal mécanisme par lequel les cellules cancéreuses du sein meurent après exposition au mélange de CBD et de THC.

En tant que première étape dans l'initiation de la voie apoptotique intrinsèque, il est crucial de déterminer l'équilibre entre différents marqueurs apoptotiques tels que les protéines pro-apoptotiques Bax et anti-apoptotiques Bcl-2, qui déclenchent un dysfonctionnement mitochondrial et dictent le destin cellulaire 52 . Dans cette étude, l'analyse par transfert Western a révélé une régulation négative de l'expression de la protéine Bcl-2 sans altération de l'expression de Bax dans les deux lignées cellulaires. Il est suggéré que le rapport Bax/Bcl-2 est d'une grande importance pour déterminer la perte de l'intégrité de la membrane mitochondriale puisqu'il agit comme un « rhéostat » dans la régulation de la fonction mitochondriale 53 . Nos résultats ont confirmé la régulation positive significative du rapport Bax/Bcl2 lors de l'exposition des cellules MDA-MB-231 et MCF-7 au mélange CBD/THC, suggérant donc la perturbation de la membrane mitochondriale externe. Français Cela permet à son tour la formation de pores et la libération ultérieure de facteurs apoptogènes tels que le cytochrome c dans le cytoplasme, ce qui a également été évalué et confirmé dans notre étude. Compte tenu de ces résultats, nous pouvons conclure que la voie apoptotique intrinsèque est activée dans les deux lignées cellulaires du cancer du sein de manière similaire aux études précédentes dans lesquelles les cannabinoïdes, CBD ou THC, étaient capables de favoriser l'activation de la voie apoptotique dépendante des mitochondries via l'augmentation de Bax/Bcl-2, la perte de l'intégrité de la membrane mitochondriale et la libération de cytochrome dans le cytosol 54 , 55 , 56 . Ensuite, nous avons suggéré que l'activation de cette voie pourrait être due à un stress oxydatif interne causé par une augmentation de la formation de ROS. Par conséquent, un test de production de ROS instantané et dépendant du temps a été effectué sur les deux lignées cellulaires. Nos données montrent que ce mélange présente un effet protecteur sur les deux cellules cancéreuses du sein via son activité antioxydante, ce qui pourrait être en partie dû à la teneur élevée en CBD, précédemment établie pour ses propriétés antioxydantes. Il a été récemment démontré que les cannabinoïdes peuvent favoriser l’activation d’une voie apoptotique indépendante du stress oxydatif dans les cellules cancéreuses pancréatiques via l’axe mitochondrial 57 , 58 .

La voie d'exécution est l'étape terminale finale de l'apoptose conduisant à l'apparition de marques apoptotiques, notamment le boursouflure membranaire, le rétrécissement cellulaire et la fragmentation de l'ADN 59 . Pour confirmer davantage l'induction de la voie apoptotique d'exécution, l'expression de la caspase 3 clivée, une protéine régulatrice clé de cette voie, a été évaluée et s'est avérée être régulée à la hausse dans MDA-MB-231 et MCF-7 après 24 h de traitement. La caspase 3 est connue pour être clivée en ses formes actives pendant l'apoptose. Par conséquent, afin de confirmer l'activation de la voie d'exécution, nous avons évalué le rôle de la caspase 3 active dans la promotion de la fragmentation de l'ADN via le clivage de PARP des fragments de 116 à 89 kDa et 24 kDa. PARP est une protéine majeure qui joue un rôle crucial dans la réparation de l'ADN grâce à son domaine de liaison à l'ADN qui reconnaît les lésions de l'ADN et recrute le mécanisme de réparation de l'ADN 60 . Les données obtenues ont révélé une augmentation significative de l'expression de PARP clivée dans les deux lignées cellulaires du cancer du sein. Ces résultats sont cohérents avec l'augmentation observée de l'apoptose démontrée par la cytométrie de flux et l'ELISA de mort cellulaire réalisés. Pour confirmer davantage que le mélange de cannabinoïdes favorise une mort cellulaire dépendante de la caspase, un inhibiteur de caspase pan, Z-VAD-FMK, a été utilisé. La combinaison de CBD et de THC avec Z-VAD a révélé une viabilité significativement plus élevée dans les cellules MDA-MB-231 et MCF-7 après 24 et 48 h de traitement, respectivement. Ainsi, la présence de Z-VAD a inversé, de manière dépendante du temps, l'effet cytotoxique du mélange CBD/THC, ce qui a confirmé l'induction d'une voie apoptotique dépendante de la caspase. En fait, plusieurs études ont démontré l'activité apoptotique des composés cannabinoïdes sur différents types de cancer en favorisant l'apoptose via l'activation du mécanisme d'exécution. Il a été démontré que le traitement unique au CBD et au THC induisait l'apoptose via la caspase 3 ainsi que le clivage de PARP dans les cellules cancéreuses du poumon, du côlon et du sein 45 , 51 , 61 , 62 , 63 .

Il a été précédemment établi que les cannabinoïdes pourraient également favoriser l'activation du mécanisme de mort cellulaire programmée par autophagie dans divers types de cancer. Dans cette étude, nous nous sommes intéressés à évaluer le rôle du co-traitement au CBD et au THC sur l'autophagie dans les lignées cellulaires du cancer du sein en examinant les niveaux de plusieurs marqueurs protéiques corrélés à l'autophagie. Nos résultats ont montré que le mélange de cannabinoïdes provoquait une augmentation des niveaux de la protéine liée à la membrane de l'autophagosome, LC3B, dans les deux cellules du cancer du sein. Cela concorde avec des études précédentes rapportant une expression accrue de la protéine LC3B dans les lignées cellulaires du mélanome et du cancer du sein 18 , 45 . Il a également été constaté que le monotraitement au CBD favorise une augmentation modeste de l'expression de LC3B par rapport à sa combinaison avec le THC, qui a considérablement amélioré son expression dans les cellules du myélome multiple 64 . Ces études ont ensemble corrélé la régulation positive de LC3B à une augmentation de l'autophagie inductible au-dessus du niveau de base. Il convient de noter qu'une augmentation de LC3B pourrait être due à une augmentation de l'induction de l'autophagie ou à une inhibition des dernières étapes de l'autophagie, à savoir le flux autophagique. De plus, une interaction entre l'autophagie et l'apoptose est controversée, c'est pourquoi Beclin-1, une protéine étroitement régulée par les caspases apoptotiques et impliquée dans les premières étapes de l'autophagie, a également été évaluée dans cette étude. Il est intéressant de noter que nos résultats ont révélé une expression régulée à la baisse de Beclin-1 dans les deux lignées cellulaires traitées avec le mélange de cannabinoïdes. Des rapports antérieurs ont fourni la preuve que Beclin-1, un substrat de caspase et membre du complexe PI3K de classe III, est clivé lors de l'activation de la caspase-3 pendant l'apoptose 65 , 66. Dans cette étude, nous avons constaté que la surexpression de Beclin-1 n'est plus détectée, ce qui pourrait être dû à son clivage par les caspases, en particulier la forme clivée de la caspase 3 lors de l'induction de l'apoptose. Étant donné que nous avons observé une augmentation de LC3B et des résultats contradictoires de Beclin-1 en plus des données obtenues lors du traitement à la CQ qui n'a pas pu inverser l'effet cytotoxique du CBD/THC, une évaluation visuelle de la protéine LC3B liée à la membrane de l'autophagosome a été réalisée. L'évaluation microscopique a confirmé l'accumulation de vésicules autophagiques dans le cytosol lors de l'exposition des cellules au CBD/THC. Cependant, cette observation pourrait être attribuée à une induction de l'autophagie au-dessus du niveau de base, ou elle pourrait être corrélée à la capacité du traitement à inhiber le flux autophagique. Ainsi, les résultats de l'immunocoloration ont révélé une accumulation d'autophagosomes dans les cellules traitées au CBD/THC similaire et même plus prononcée que celles traitées au CQ seul. Ainsi, cela pourrait suggérer que le traitement aux cannabinoïdes est encore plus efficace que le CQ pour inhiber le flux autophagique et pourrait donc expliquer pourquoi aucune inversion de la mort cellulaire n'a été observée lors de la combinaison de CBD/THC avec l'inhibiteur. Étant donné cela, nous avons cherché à évaluer le Wort, un autre inhibiteur des premiers stades de l'autophagie pour évaluer sa capacité à inverser complètement la mort favorisée par le médicament. De même, nous avons constaté que le Wort n'était pas capable d'abolir la mort cellulaire induite par le CBD/THC tout en observant une diminution visuelle du nombre de cellules lors de l'exposition des cellules au mélange de cannabinoïdes avec le Wort. Cela confirme nos conclusions précédentes selon lesquelles la mort cellulaire du cancer du sein est principalement corrélée à l'apoptose plutôt qu'à l'autophagie et que les voies apoptotiques sont plus efficaces pour favoriser la mort cellulaire. En fait, l'apoptose s'est avérée déclenchée plus tôt comme observé par l'activation de la caspase 3 par son clivage à 12 h même lorsque Beclin-1 n'était toujours pas significativement régulée à la baisse. L'activité de Beclin-1 est perdue lors de la translocation de son fragment clivé dans les mitochondries, stimulant la susceptibilité des cellules à la mort apoptotique 66 . Par conséquent, l'autophagie pourrait ne pas être le mécanisme principal par lequel les cellules cancéreuses du sein meurent puisque l'apoptose est activée à des stades plus précoces, réprimant les niveaux basaux d'autophagie. Bien que des études récentes aient fourni des informations précieuses sur les mécanismes par lesquels les principaux cannabinoïdes, à savoir le CBD et le THC, favorisent la mort cellulaire, les voies et récepteurs spécifiques qui régissent leur effet restent flous. Les deux principaux récepteurs cannabinoïdes CB1 et CB2 par lesquels les phytocannabinoïdes pourraient exercer leur effet physiologique ont déjà été établis pour leur rôle dans le système endocannabinoïde 67. Cependant, plusieurs études ont rapporté la faible affinité du CBD pour ces deux récepteurs, suggérant son interaction possible avec d'autres canaux tels que le récepteur potentiel vanilloïde (TRPV) et le récepteur couplé à la protéine G orpheline 55 (GPR55) entre autres 16 , 68 . Dans l'ensemble, les effets thérapeutiques des cannabinoïdes sont plus complexes car ils pourraient impliquer plusieurs récepteurs au-delà des récepteurs bien établis, CB1 et CB2.

Les métastases demeurent la principale cause de décès chez les patients atteints de cancer. Des rapports antérieurs ont révélé le rôle important des cannabinoïdes dans l'inhibition de la migration et de l'invasion de divers types de cancer, notamment les cellules cancéreuses du sein, du col de l'utérus et du poumon 69 , 70 . Dans cette étude, nous avons évalué l'effet inhibiteur du mélange CBD/THC sur la motilité de la lignée cellulaire TNBC, considérée comme le type de cancer du sein le plus agressif. Le test de cicatrisation des plaies a montré une altération de la motilité du MDA-MB-231, similaire aux résultats du test de migration trans-puits dans lequel nous avons évalué la capacité des cellules traitées à se déplacer à travers une membrane poreuse. Nos données ont révélé une suppression notable et significative de la migration cellulaire par rapport au témoin. Le processus de métastase ne dépend pas uniquement de la capacité migratoire des cellules cancéreuses, mais également de leurs propriétés invasives et de leur capacité à dégrader la matrice extracellulaire 71 . Les cellules cancéreuses acquièrent leurs propriétés invasives par l'expression de plusieurs marqueurs invasifs, en particulier les MMP. Ces protéines ont été précédemment établies pour leur activité protéolytique et leur capacité à dégrader la matrice extracellulaire (ECM), favorisant ainsi l'invasion et la progression cellulaires 72 . Par conséquent, nous avons étudié l'effet du mélange CBD/THC sur la suppression de l'invasion des cellules cancéreuses du sein en évaluant la capacité du MDA-MB-231 à dégrader le Matrigel et à traverser la membrane de la chambre de Boyden. Nos résultats sont conformes aux études précédentes qui ont montré une diminution de la capacité invasive des cellules souches du carcinome à cellules urothéliales, de la prostate, du gliome et du glioblastome, entre autres 1 , 16 , 73 , 74 . Des études antérieures ont rapporté que l'activité anti-métastatique du CBD ou du THC était médiée par la régulation négative des MMP parmi plusieurs autres facteurs pro-métastatiques 16 . En fait, Elbaz et ses collègues ont rapporté que dans le cancer du sein, le traitement au CBD peut inhiber l'invasion cellulaire en supprimant la sécrétion de MMP-2 et MMP-9 69 . Des études antérieures ont rapporté que les cannabinoïdes, dont le CBD, pourraient présenter leur effet anti-métastatique de manière dépendante ou indépendante du CB1/CB2 75. Dans l'étude actuelle, le mélange de CBD/THC a révélé une activité anti-métastatique sur les cellules TNBC via une régulation négative de l'expression des MMP, à savoir MMP-2 et MMP-9. En prenant ces résultats ensemble, nous pouvons conclure que le mélange de cannabinoïdes majeurs isolés de la plante de cannabis libanaise, favorise non seulement l'activation du mécanisme de mort cellulaire programmée, mais supprime également les capacités migratoires et invasives des cellules cancéreuses du sein agressives, in vitro. À ce jour, plusieurs études ont évalué les propriétés anticancéreuses des cannabinoïdes sur divers types de cancer, révélant leurs propriétés antiprolifératives, pro-apoptotiques, anti-invasives et anti-métastatiques prometteuses sur divers types de cancer, in vitro et in vivo 76 .

Conclusion

Avant l’utilisation du cannabis dans les systèmes médicaux occidentaux, C. sativa était utilisé depuis au moins 1800 ans. Il est bien établi que ses constituants biochimiques sont principalement responsables des diverses fonctions associées à sa consommation. Notre étude a montré que le CBD et le THC isolés des souches de cannabis libanaises, dans des proportions comparables aux plantes médicinales, présentent un effet prometteur sur les lignées cellulaires du cancer du sein. L’activité anticancéreuse de ce mélange a été révélée par sa capacité à favoriser la fragmentation cellulaire, la translocation de la phosphatidylsérine et la fragmentation de l’ADN tout en inhibant la motilité des cellules cancéreuses du sein agressives. Nos résultats ont montré une activité pro-apoptotique sur les cellules MDA-MB-231 et MCF-7 via l’activation de la voie apoptotique intrinsèque. De plus, nous avons constaté que même si l’autophagie était altérée dans les lignées cellulaires du cancer du sein, elle n’est pas le mécanisme majeur conduisant à la mort cellulaire. De plus, nous avons démontré que ce mélange était efficace pour arrêter la progression des cellules cancéreuses du sein via la suppression de la migration et de l’invasion des cellules cancéreuses. Des recherches plus poussées sont nécessaires pour mieux comprendre les mécanismes d’action responsables de l’effet observé. Plus précisément, l’étude de l’interaction entre les deux mécanismes de mort cellulaire programmée, l’apoptose et l’autophagie, permettra de mieux comprendre les mécanismes complexes impliqués. De plus, l’identification des récepteurs impliqués dans la médiation de l’effet thérapeutique observé est essentielle pour développer une thérapie ciblée. L’évaluation des propriétés anticancéreuses de ce mélange de cannabinoïdes sur d’autres lignées cellulaires du cancer du sein est également essentielle pour comprendre l’activité plus large du mélange sur différents sous-types de cancer du sein. Ces travaux ouvrent la voie à de futures recherches qui doivent être menées in vivo et à un stade ultérieur, dans le cadre d’essais cliniques visant à améliorer la santé des patientes atteintes de cancer.

Disponibilité des données
Toutes les données générées et analysées dans cette étude sont mentionnées dans ce manuscrit.

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Financement
Le projet a été financé par des fonds internes du Département des sciences naturelles de l'Université libanaise américaine, pour garantir l'espace, l'équipement et les consommables.

Informations sur l'auteur
Auteurs et affiliations
Département des sciences naturelles, Université libano-américaine, Byblos, Liban

Maria Younes et Sandra Rizk

École de pharmacie, Université libano-américaine, Byblos, Liban

Marissa El Hage, Wassim Shebaby, Sahar Al Toufaily, Jana Ismail et Mohammad Mroueh

Département de biochimie, Université de médecine vétérinaire de Hanovre, Hanovre, Allemagne

Hassan Y. Naim

Contributions
Réalisation d'expériences, collecte de données et analyse formelle : MY Figures et préparation de la première ébauche : MY Collecte et analyse d'extraits de plantes rapportées : WS, JI, SAT et MEH Conceptualisation et révision finale du manuscrit : MM, HYN et SR Acquisition de financement, méthodologie, administration du projet et supervision : SR Tous les auteurs ont lu et accepté la version publiée du manuscrit.

Auteur correspondant
Correspondance à Sandra Rizk .

Déclarations éthiques
Intérêts concurrents
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêt.

Informations Complémentaires
Note de l'éditeur
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Matériel électronique supplémentaire
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